I fondi antichi a stampa gambalunghiani sono il risultato di ampie stratificazioni: il nucleo originario, costituito dalla biblioteca di Alessandro Gambalunga, è stato via via incrementato dalle acquisizioni dei bibliotecari, dalle donazioni di privati ed enti e, in maniera massiccia, dall'incameramento dei patrimoni librari delle corporazioni religiose al tempo delle soppressioni napoleoniche e post-unitarie. Si sono comunque sviluppati in maniera coerente con l'impianto umanistico della biblioteca del fondatore, che se da una parte aveva privilegiato la presenza delle opere dei principali esponenti delle diverse scuole giuridiche dall'XI al XVI secolo, dall'altra aveva rivolto particolare attenzione alle lingue e agli autori classici, senza trascurare la letteratura volgare, la geografia e la letteratura di viaggi, la medicina, le scienze naturali, la teologia, l'astronomia e la letteratura d'occasione. Nell'attuale assetto delle raccolte gambalunghiane sono infatti ben rappresentati questi ed altri ambiti disciplinari più o meno affini, negli esiti più vitali prodotti nel corso dei secoli.
Tale ingente patrimonio librario, collocato sia nelle sale antiche A, B, C (sale seicentesche) e D (sala settecentesca) sia nei magazzini librari (sale 7 e 12) sia in sala manoscritti (segnature 9 e 4), conta circa sessantamila volumi.